www.fuxinlan.com&token=wovaTZHhpIIpcRo1 PCR實(shí)驗室建設-北京中科斯麥公司專(zhuān)業(yè)

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                      PCR實(shí)驗室


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                      、建立樣品準備區

                        這個(gè)區域專(zhuān)門(mén)用作樣品的準備,在制備和操作用于核酸提取的試劑時(shí)應該采取預防措施:

                        ⑴PCR產(chǎn)物和帶有要擴增序列的DNA克隆不能在這個(gè)房間操作。

                        ⑵組織培養物、組織標本和血清樣品都帶進(jìn)樣品準備間處理,以根據應用的需要提取DNARNA。

                        ⑶用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具,也不能用作操作靶序列。

                        ⑷DNA樣品應該用有專(zhuān)門(mén)的防護或正  壓活塞式移液管操作,以防止在吸取樣品時(shí)有氣溶膠遺留。

                        ⑸大體積樣品應該用單獨包裝的無(wú)菌一次性移液管吸取。

                        ⑹管子打開(kāi)前都要簡(jiǎn)短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生,而且管子不能用力崩  開(kāi),這樣會(huì )產(chǎn)生氣溶膠。

                        ⑺任何時(shí)候都應該穿實(shí)驗服和帶手套,手套要經(jīng)常更換,尤其在抽提過(guò)程中每一步之間都要更換。實(shí)驗服要專(zhuān)門(mén)用于樣品準備間,經(jīng)常清洗。

                      、樣品準備和RNA-PCR RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作,這樣增加了樣品之間污染的機會(huì )。為了避免這一問(wèn)題,反轉錄一步可以在樣品準備區進(jìn)行。在RNA-PCR中應用UNG以防止污染的方法也有報道。

                      、建立前PCR區。該去專(zhuān)門(mén)用于準備各種反應,這個(gè)區域必須保持干凈,而且沒(méi)有來(lái)自克隆和樣品準備的污染。前PCR區必須要有試劑和準備,特別是專(zhuān)門(mén)用于前PCR區的正壓活塞式移液管。

                      、PCR實(shí)驗室試劑的操作。

                        ⑴所用的所有溶液都應該沒(méi)有核酸和(或)核酸酶(DNaseRNase)污染。

                        ⑵所有PCR試劑中使用的水都應該是高質(zhì)量的-新鮮蒸餾的去離子水,用0.22μm過(guò)濾的,并且是高壓滅菌。

                        ⑶在20℃到25℃貯存的試劑建議加點(diǎn)像疊氮鈉一類(lèi)的抗微生物劑,在擴增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴增反應。

                        ⑷所用試劑都應該以大體積配制,實(shí)驗一下看試劑是否滿(mǎn)意,然后分裝成僅夠一次使用的量進(jìn)行貯存。

                        ⑸所有試劑和樣品準備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。

                        ⑹新配制的試劑在用于準備新的標本之前應該加以檢驗。

                        ⑺樣品準備和前PCR區所使用的移液管在不使用時(shí)都應該小心保存。

                      、在前PCR區建立PCR混合物。

                        ⑴可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃,在實(shí)驗室只涉及到擴增一種或少數幾種特異序列時(shí)這樣做很有用。

                        ⑵如果你的實(shí)驗室使用多套引物,以致于配制包括所有試劑的單一反應混合物不夠經(jīng)濟,可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。

                        ⑶作為一個(gè)規則,應該保存一套陰性、弱陽(yáng)性和強陽(yáng)性對照樣品來(lái)分析樣品配制和PCR前過(guò)程的效率和潔凈程度。而且,你也希望通過(guò)使用一個(gè)已知的弱陽(yáng)性樣品來(lái)驗證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴增抑制物。

                        ⑷陰性樣品要與每組樣品同時(shí)做,以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產(chǎn)物的污染,陰性對照應該包括核酸以外的所有試劑。

                        ⑸當做陽(yáng)性對照時(shí),有兩個(gè)理由決定了應該使用少數量的核酸。

                        ⑹由于必須有對照反應,對照模板的特點(diǎn)應該予以考慮。

                      、控制污染的方法。

                            已設計出很有力的酶學(xué)方法用來(lái)消除一種形式的污染—使用UNG,這一技術(shù)能有效地消除由PCR產(chǎn)物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線(xiàn),這種方法不能完全消除污染問(wèn)題,但可以將污染降低幾個(gè)數量級。

                      、后PCRPCR完成以后,需要分析樣品并解釋數據,應該留出一個(gè)專(zhuān)門(mén)用于反應后處理樣品的 地方。后PCR活動(dòng)中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專(zhuān)門(mén)用于這一目的,決不能把實(shí)驗室這一區域的試劑或儀器用于任何前PCR活動(dòng)。

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